IPS诱导肠类器官的培养过程可以分为三个主要阶段：人多能干细胞培养、内胚层分化及中/后肠模式化诱导以及最终的类器官培养。本文将重点讨论第三个阶段——类器官培养，通常持续14至28天。

在类器官培养之前，要完成一系列准备工作，包括试剂和耗材的准备。所需材料包括人正常肠类器官培养试剂盒（型号：abs9545）、低因子无酚红基质胶（型号：abs9495）、15ml离心管（型号：abs7102）、24孔细胞培养板（型号：abs7035）等。具体的组分和规格如下：

• 类器官培养基A：100ml
• 类器官原代培养缓冲液B：250ml
• 类器官传代消化液D：30ml
• 组织保存液E：100ml
• 类器官冻存液F：20ml

操作流程

1. 加胶、点板与加液

首先，准备工作需在冰上进行，确保基质胶在4℃下融化，并将枪头和离心管预冷至-20℃。接下来，在24孔板的每个孔中加入25μl基质胶和500-750μl类器官培养基，保证细胞团的接种密度为1:1（基质胶:球状体），通常建议使用300μl基质胶。

2. 类器官的收集与传代

在类器官数量较多或体积较大的情况下，首先用4℃传代培养缓冲液G轻轻吹散基质胶，然后收集类器官沉淀并洗涤。接着，采用300g的离心条件将其分层，依据层次状态处置。若分层不明显，可进行再次洗涤以确保更好的分离效果。

3. 类器官冻存

冻存时，类器官不需消化，最好在其指数增长期进行。通过添加适量的冻存液，轻柔吹打重悬后，实施梯度冻存，将冻存管先放置于-80℃过夜再转入液氮罐。

4. 类器官复苏

复苏时需将冻存管迅速解冻，并在超净工作台中进行消毒操作。将类器官冻存液转移至离心管中，加入类器官传代培养缓冲液后轻柔混匀，最后重新接种到培养板中。

注意事项

• 必需在冰上操作基质胶，避免提前固化。
• 进行细胞培养时，需确保细胞融合度在85%-90%之间，以促进球状体的形成。
• 务必使用新鲜的生长因子，避免反复冻融导致活性降低。
• 采取严格的无菌操作，定期检测支原体污染情况。

通过细致遵循上述步骤，不仅可以高效生成功能性人类肠道类器官，同时也为疾病建模、药物筛选等研究奠定基础。

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