IPS诱导肠类器官培养可分为三个主要阶段：人多能干细胞培养、内胚层分化、以及中/后肠模式化诱导。本篇将聚焦于第二阶段，即内胚层分化及中/后肠模式化诱导。

一、前期准备

1. 试剂与设备

为了进行内胚层分化，需要准备以下试剂与设备：

• 细胞：H1/H9 hESC或患者源iPSCs。
• 培养基：人多能干细胞培养基 (abs9403)、RPMI1640 (abs9484)。
• 消化液：人多能干细胞消化液 (abs9409)。
• 培养基添加剂：L-丙氨酰-L-谷氨酰胺溶液 (2mM) (abs9295)、双抗 (abs9244)。
• 生长因子：Activin A (100ng/mL) (abs05801)、FGF4 (500ng/mL) (abs06269)、WNT3a (500ng/mL) (abs05632)。
• 基质胶：即用型基质胶（培养板包被）(abs9410)以及类器官专用基质胶 (abs9495)。
• 血清：透析胎牛血清 (abs945)。
• 关键设备：表面培养皿、立体显微镜、无菌手术刀和预冷微量离心管。

2. 试剂配制

内胚层分化培养基的配制如下：

• Day 1：RPMI1640 + L-丙氨酰-L-谷氨酰胺溶液 (2mM) + 双抗 (1%) + Activin A (100ng/mL)。
• Day 2：Day 1 配方 + 透析胎牛血清 (0.2%)。
• Day 3：Day 1 配方 + 透析胎牛血清 (2%)。

中/后肠分化培养基的配制如下：

• RPMI1640 + 透析胎牛血清 (2%) + FGF4 (500ng/mL) + WNT3a (500ng/mL)。

二、hPSCs传代与铺板

1. 细胞传代（耗时2小时）

使用人多能干细胞消化液，将hPSCs消化至边缘卷起。用细胞刮刀轻柔剥离细胞团，并反复吹打至1-2mm大小。按1:6的比例将其接种至Matrigel包被的24孔板（每孔约5000个细胞团），轻敲培养板以确保细胞均匀分布，然后在37°C下培养过夜。

2. 细胞扩增至85-90%融合（3-4天）

每日更换人多能干细胞培养基，观察细胞密度。注意：如果细胞密度过高（可能导致自发分化）或过低（分化效率降低），则需要重新铺板。

三、内胚层分化（为期3天）

1. Day 1

吸除人多能干细胞培养基，加入Day 1内胚层培养基（无血清），培养24小时。

2. Day 2

更换为Day 2内胚层培养基（含0.2%透析胎牛血清），培养24小时。

3. Day 3

更换为Day 3内胚层培养基（含2%透析胎牛血清），培养24小时。

4. 验证分化效率（可选）

可通过免疫染色检测FOXA2/SOX17双阳性细胞，理想的分化效率应达到85-90%。

四、中/后肠模式化（为期3-4天）

1. 诱导球状体形成

吸除内胚层培养基，添加中/后肠分化培养基，每日更换。在48小时后，通过立体显微镜观察上皮增厚，并在72-96小时内观察到球状体从单层细胞中脱离。

2. 收集球状体

使用200μL枪头收集游离球状体，每管约50个，置于冰上备用。

本期鸿运国际推荐产品：

• abs9403 人多能干细胞培养基 500ml
• abs9409 人多能干细胞消化液 100mL
• abs9295 L-丙氨酰-L-谷氨酰胺溶液（100×，200mM） 100mL
• abs9410 即用型基质胶 100mL
• abs9484 RPMI1640 500mL
• abs945 透析胎牛血清 500mL

如需了解更多，请访问鸿运国际的官方网站，或通过邮箱联系我们。我们提供多种生物医药相关的高品质试剂，助力您的科研及临床研究。