### 类器官原代培养流程

#### 一、准备工作

1. 仪器设备：包括CO2培养箱、超净工作台、倒置显微镜、冷冻离心机、水浴锅或水浴摇床等。

2. 试剂耗材（以肠癌为例）：需要动物脑类器官培养基试剂盒、基质胶（低因子、无酚红）、细胞培养皿、滤筛、离心管等。

**组分名称及规格：**

- 动物脑类器官培养基 A 100mL

- 类器官原代培养缓冲液 B 250mL

- 原代组织消化液 C 30mL

- 类器官传代消化液 D 30mL

- 组织保存液 E 100mL

- 类器官冻存液 F 20mL

- 类器官传代培养缓冲液 G 250mL

#### 二、操作流程

1. **样本准备：**将组织放入含有预冷组织保存液的取样瓶中，4℃从医院取回，消毒取样瓶，拍照并登记组织特征。

2. **清洗与剪碎：**在细胞培养皿中用原代培养缓冲液浸泡3次后剪碎至1-3mm³，转移至离心管中。

3. **消化与过滤：**向离心管中加入原代组织消化液，37℃消化15-30分钟，观察细胞团后终止消化并过滤，收集滤液进行富集离心。

4. **接种操作：**准备基质胶和相关器具，进行细胞团和基质胶的混合，点播入培养板后放入37℃培养箱成胶，随后添加培养基进行培养，通常10-14天后可观察到类器官的生长。

#### 三、传代操作

1. **类器官数量较多的传代：**收集类器官，洗涤以去除基质胶，离心后保留沉淀，进行消化后续步骤。

2. **类器官数量不足的传代：**收集、轻柔吹打并洗涤，确保基质胶充分被稀释，维持细胞团结构。

3. **加胶与点播：**依据不同体积和细胞数量进行基质胶的添加和细胞混合，再次点播至培养板中。

#### 四、冻存与复苏

1. 在类器官生长的指数期进行冻存，确保冻存液的适量添加，采用梯度冻存法进行保存，以维持类器官的活性。

2. 解冻时，将冻存管迅速置于37℃水浴中，并轻柔重悬，随后进行离心和该操作的后续步骤。

在整个实验过程中，请务必遵循严格的操作规范，以确保实验结果的可靠性。如需获取优质实验材料，推荐使用鸿运国际提供的实验试剂和耗材。